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          基因毒性雜質——亞硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺的控制

          發布時間:2020-03-20

          :基因毒性雜質(GTI)相關指導原則

          目前,ICH成員國如美國、歐盟、中國均以ICH  M7R1)為最新核心指導文件。

          ICHM7R1Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Risk,2018.03

          ICHS2R1Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use, 2012

          EMAGuideline of the limits of genotoxic mpuritie,2006

          FDAGuidance for Industry, Genotoxic and carcinogenic impurities in Drug Substances and Drug Products: Recommended Approaches,Draft,2008

          NMPA:藥物遺傳毒性研究技術指導原則,2018.03

          二:基因毒性雜質(GTI)研究思路

          識別GTI→進行危害性評估、風險表征制定研究策略制定限度建立分析方法進行控制。

          1、識別GTI

          識別GTI需要從概念和原理出發。GTI關注較低水平即可造成DNA損傷、突變、可能引發癌癥的DNA活性物質。那么,DNA的結構你還記得嗎?核糖或脫氧核糖中C1上的半縮醛羥基(β-構型)與嘌呤堿基上的N9-H或嘧啶堿基上的N1-H脫水連接而成核苷;核苷再被磷酸酯化(脫氧核糖中5’位和核糖中5’位上的羥基被磷酸酯化)后,形成作為DNARNA基本結構的核苷酸。核苷酸堿基上的氮、氧,磷酸酯骨架富有電子,容易與缺電子的試劑發生取代等反應。而GTI就是親電試劑或者可以代謝成親電試劑,然后和DNA的親核基團發生反應。我們可以從公開的毒理學數據庫ToxNet 、CCRIS、CPDB、DSSTox等進行搜索,也可以根據匯總的GTI結構特征進行判斷、推理[1,2]。

          本文先從亞硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺著手,和大家一起探討、研究該類物質的結構特征。

          亞硝基-硝基芳香化合物-芳胺類

           

          上圖中:

          1 為亞硝基芳香化合物;

          2 為硝基取代芳香化合物;

          3 為一級芳胺;

          4、5 為能生成芳胺的基團;

          6、7 為芳基取代的羥胺及其衍生酯;

          含氮芳香環(指含有芳香胺、硝基、亞硝基或羥胺基團的化合物)在體內P450酶的作用下先形成N-羥基胺,再與DNA反應,產生毒副作用。

          經文獻檢索,含有這類基因毒雜的部分藥物較多,舉例如下(見表1):

          1 含有亞硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺的藥物

          藥物名稱

          基因毒性雜質名稱

          鹽酸蘭地洛爾

          3-[4-(3-硝基苯磺酰氧基)苯基]丙酸

          伐沙班

          4-(4-氨基苯基)-3-嗎啉酮

          甲苯磺酸拉帕替尼

          4-(3-氟苯甲氧基)-3-氯苯胺

          阿莫西林鈉、鹽酸利多卡因注射液

          N,N-二甲基苯胺

          甲磺酸伊馬替尼

          伊馬胺

          吉非替尼

          3--4-氟苯胺、3,4-二氟苯胺、3--4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺等

          2、進行危害性評估、風險表征

          參考ICH M7(R1)6.危害性評估”、“7.風險表征”。

          3、制定研究策略

          M7R1)“8.控制”所述,構建適當的控制策略的基礎是要全面理解原料藥生產工藝相關的化學信息、制劑生產工藝以及原料藥和制劑的整體穩定性。實際工作中,多數研究、控制工作集中在原料藥部分,因而“8.1 工藝相關雜質的控制”項下開發原料藥控制策略的4種方法尤其重要(表2)。   

          2 原料藥中GTI控制策略(4種可能的方法)

          可能方法

          具體內容

          方法1

          在原料藥中對雜質檢測,用合適方法將標準設定在可接受限度內。

          方法2

          在起始物料、中間體或原料中對雜質檢測或過程控制,用合適方法將標準設定在可接受限度內。

          方法3

          在起始物料、中間體或原料中對雜質檢測或過程控制,制定一個高于原料藥中該雜質可接受限度的標準,用合適的方法并結合對雜質去向和清除的認知以及相關的工藝控制,保證原料藥中雜質的水平低于可接受限度而無需在后續工藝中再行檢測。

          方法4

          明確工藝參數及其對殘留雜質水平(包括去向和清除知識)的影響,確信原料藥中的雜質水平將會低于可接受限度,則建議無需對該雜質進行分析檢測(即不需要將雜質訂入任何質量標準中)。

          4、制定限度

          在進行危害性評估、風險表征基礎上詳細制定雜質限度,可接受攝入量AI的計算方法有:

          1標準方法,即基于線性作用方式進行AI計算;

          2其他算法,即主要是考慮人類腫瘤相關性及公布的法規限度的具體情況來制定;

          3非線性(閾值)的作用方式來進行PDE的計算。

          5、建立分析方法進行控制

          根據起始原料、中間體、原料藥的物理特性(如溶解性、沸點)、化學活性,待測雜質的極性、揮發性、結構特征,以及檢測器極限等主要因素來選擇合適的分析方法??梢越梃b的決策思路如下圖。

          分析方法決策思路

          分析方法決策思路示例圖

          對于亞硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺,常用的檢測方法有:

          1)直接檢測法:該類化合物可以直接用普通GC、LC檢測;對于硝基取代芳香化合物,GC-NICI-MS方法具有良好的靈敏度和選擇性,LOD可達0.002-0.067ng/g。對于芳胺,LC-MS/MS方法檢測時LOQ 1-10mg/kg,回收率88-116%[3];另外,APPI技術也適用于硝基多環芳烴的檢測。值得注意的是,該類化合物的諸多報道見于環境監測領域,前期調研時可以多加關注。

          2)衍生法:對于芳胺,可以用氯甲酸己酯與芳胺反應引入己基親酯鏈以增強液相保留[4];丹酰氯與胺類反應也可以改善保留及液相質譜響應;用五氟苯甲醛將廢水中的苯胺類化合物進行衍生后用GC-MS檢測等。

          三:舉例分析

          某原料藥項目起始物料之一為硝基取代芳香化合物,但Ames 試驗為陰性;其在中間體X中副產物B同樣屬于硝基取代芳香化合物(但與原料藥結構無關),同時無致突變致癌數據。因而該副產物歸為3類:有與原料藥結構無關的警示結構,無致突變性數據。該原料藥屬于長期用藥,遂歸為“7.1:基于TCC的可接受攝入量(針對治療大于10年,且無致癌性數據的2、3類)”。再根據計算出限度,本例中限度為5ppm。因而需要制定研究策略,保守起見依照表2中方法2:在起始物料、中間體和原料中對雜質檢測,或過程控制,用合適方法將標準設定在可接受限度內。適當情況下,更優選擇為方法3:即工藝清除理論研究和分析檢測的結合。Andrew Teasdale等人指出雜質的總理論清除因子OTPF/要求的清除因子RPF大于100時,則不需進行測試或進行半定量清除因子風險說明[5]。
          根據中間體X的溶解性、副產物B的結構特征(含2個羥基、不屬于揮發性物質、含有紫外吸收基團)及所需達到的限度標準,綜合考慮采用40%甲醇-水作為稀釋劑,采用5mM乙酸銨-乙腈作為流動相、LC-MS(ESI-)進行分析。定量限達到限度濃度水平的20%,線性、重復性、準確度等驗證指標符合要求。

          四:參考文獻

          [1] Romualdo Benigni et al.Structure alerts for carcinogenicity, and the Salmonella assay system: A novel insight through the chemical relational databases technology. ,Mutation Res,2008.

          [2]馬磊,馬玉楠,等.遺傳毒性雜質的警示結構。中國新藥雜質2016.

          [3] Patrick Kämpfera,Stéphanie Crettaz,et al. Quantitative determination of 58 aromatic amines and positionalisomers in textiles by high-performance liquid chromatography withelectrospray ionization tandem mass spectrometryPatrick. Journal of Chromatography A 2019.

          [4] David Q. Liu, Mingjiang Sun, Alireza S. Kord.Recent advances in trace analysis of pharmaceutical genotoxic impurities,2009.

          [5] Andrew Teasdale et al.Risk Assessment of Genotoxic Impurities in New Chemical Entities:Strategies To Demonstrate Control.Org. Process Res. Dev. 2013.

           

           

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