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          化學衍生技術在微量、痕量雜質定量分析中的應用

          發布時間:2020-03-12

          化學衍生技術在微量、痕量雜質定量分析中的應用

          藥物中雜質常以GC-FID、GC-ECD、GC-MS、HPLC-UV、HPLC-MS進行分析檢測,但是有些雜質在上述儀器中的靈敏度低,甚至無法滿足檢測要求;因此可以通過化學衍生化的方法提高其靈敏度或改變檢測方式來滿足檢測要求。從而可以更好的對雜質進行控制,提供更安全的藥品。

          理想衍生化反應的特征:1)方便通用(反應試劑易得、穩定、條件溫和);2)簡單價廉(反應步驟簡單且消耗少);3)快速進行(通常在15分鐘以內完成);4)選擇良好(不與非目標分析物作用);5)反應定量(與目標分析物的作用定量進行);6)產物單一(不額外生成與檢測無關的物質)。

          液相和氣相色譜分離是常見的兩種分離方法,因此,下面將主要介紹用于氣相和液相的衍生技術。

          氣相衍生技術

          一、硅烷類衍生試劑

          胺基、巰基、羧基、羥基等的活潑氫可以被烷基硅基取代,可以利用此性質進行硅烷衍生化反應,從而使一些不易氣化的雜質易于氣化、或增強其熱穩定性。常用的硅烷化試劑如有:三甲基硅烷(TMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、三乙基硅烷(TES)、N,N-二乙胺基二甲基硅烷(DADS)、叔丁基甲氧基苯基硅烷(TBMPS)、N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-甲基硅三氟乙酰胺(MSTFA)、N-甲基硅二乙胺TMSDEA)、三甲基硅咪唑(TMSI)、N,O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-(三甲基硅基)二甲胺(TMSDMA)、N-甲基-N-(三甲基硅基)乙酰胺(MSA)、六甲基二硅氮烷HMDS)等,溶劑為非質子溶劑,如二甲基亞砜和四氫呋喃等。硅烷類衍生試劑的反應活性:醇 > > 羧酸> > 酰胺。

          二、鹵代烷類衍生試劑

          取代化合物與帶有活潑氫的化合物(如羥基、羧基等)進行烷基化反應,常見的鹵代

          烷類衍生試劑包括鹵代脂肪烷烴、鹵代、α-鹵代羰基化合物等。

          三、重氮烷類衍生試劑

          衍生化試劑舉例:重氮甲烷、重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯等。

          四、醇類衍生試劑

          衍生化試劑舉例:甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇;需用催化劑,常見催化劑為鹽酸、硫酸、BF3、BCl3或酸酐

          五、酸酐類衍生試劑

              衍生化試劑舉例:乙酸酐(AA)、苯甲酸

          六、可引入鹵素的衍生試劑

          1)鹵代酸酐法(三氟乙酸酐(TFA、五氟丙酸酐(PFP)、七氟丁酸酐(HFB)

          2)酰鹵類試劑(乙酰氯、苯甲酰氯)

          3)鹵代烷基酰胺(N-甲基雙三氟乙酰胺)(MBTFA)

          4)鹵代?;溥颍?span class="GramE">三氟乙酰咪唑(TFAI)、七氟丁酰咪唑)

          5)鹵素加成或取代

          6)鹵化氫加成或取代

          7N-溴代琥珀酰亞胺(NBS-Br)

           

          七、四甲基銨鹽熱解法

               將羧酸溶于甲醇,以24%的氫氧化四甲基銨甲醇溶液滴定至酚酞變色,加熱至350,得相應的羧酸甲酯。

          可以結合雜質結構特性和檢測器,選擇合適的衍生化試劑。比如,需要提高

          ECD靈敏度的,可以選擇能引入鹵素的衍生試劑;需要進行質譜檢測的,可以引入易于離子化的基團(比如含氮基團)等。

          液相衍生技術

          在液相色譜法中,紫外吸收檢測器是最常見的一種檢測器。但很多化合物在紫外可見光譜區無吸收,無法檢測。將它們與帶有紫外吸收基團的衍生試劑在一定條件下發生反應,由于反應產物帶有發色基團而能被檢測。

          能產生紫外吸收的物質應含有生色團:如C=C、C=O、N=N、NO2、C=S等基團,分子結構中如含有-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等助色基團時,當它們與生色團相連,能使該生色團的吸收峰向長波方向移動,并使吸收強度增加。

          熒光檢測器是一種高靈敏度、高選擇性的檢測器,比紫外檢測器的靈敏度要高10-1000倍,尤其適合痕量分析。 能產生熒光的物質的分子結構具有大共軛結構,分子具有共平面性和剛性。

          由于熒光檢測器的靈敏度高,適合于微量、痕量雜質檢測,因此,本綜述對

          熒光衍生試劑進行介紹。同氣相衍生,可以結合雜質結構特性和檢測器,選擇合適的衍生化試劑。

          液相色譜——質譜聯用技術(LC-MS)是20世紀70年代發展起來的一門新的儀器分析方法,是一種以液相色譜為主要分離手段,質譜法作為檢測手段的色譜檢測技術,集合了液相色譜儀的高分離能力和質譜儀的高靈敏度、高專屬性的特點,簡化了復雜混合物的分離純化過程。LC-MS技術已經成為藥物中微量雜質分析的首選技術,特別是多級質譜和高分辨質譜的發展和應用,能夠在線獲得化合物的豐富片段信息和分析組成信息,可根據一級、二級甚至多級質譜信息確定化合物的分子量并推斷出可能分子結構,為藥物雜質的結構鑒定提供快速、準確的方法。

          一、胺基的衍生化反應

          胺的化學性質與其原子上兩個未成對的電子有關。具有親核性,能與親電

          性化合物發生反應,容易與鹵代烴、羰基、?;衔?、酸等發生反應,因此,這些化合物經常作為胺類的衍生化試劑。

          1)酰鹵類衍生試劑

          紫外衍生試劑:對硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、對甲氧基苯甲酰氯

          熒光衍生試劑:9-芴氯(FMOC)、3,4-二氫-6,7-二甲氧基—4-甲基-3-喹惡啉-2-羰酰氯(DMMQC-Cl)、6-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯(MSQC-Cl)等。

          2)磺酰鹵類衍生試劑

              熒光衍生試劑:丹酰氯DNS-Cl、p-4,4-二甲氨基偶氮苯酰氯(DABS-Cl)、5,5-二丁氨基-1-萘磺酰氯(BNS-Cl)、N-甲基-2-苯胺基-6-酰氯、4--1-偶氮-4-二甲氨基苯)酰氯、香豆素-6-酰氯(C-6-SO2Cl)。

          3)硫代酰鹵類衍生試劑

          4)活性鹵類衍生試劑

          紫外衍生試劑舉例:2,4-二硝基氟苯(FDNB)、

          熒光衍生試劑:4--7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑 NBD-Cl)、NBD-F、NBD-Br、DBD-F、ABD-F、SBD-F等。

          5)氯甲酸酯類衍生試劑

          6)芳香鄰二醛類衍生試劑

          熒光衍生試劑:鄰苯二甲醛(OPA)、2,3-二醛(NDA)、3-2-呋喃甲?;?/span>-喹啉-2-醛(FQCA)、3-4-羧基苯甲?;?/span>-喹啉-2-醛(CBQCA

          7N-氧取代琥珀酰亞胺類衍生試劑

          紫外衍生試劑: N-琥珀酰亞胺對硝基苯乙酸酯。

          熒光衍生試劑:6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯(AQC)、SIIA、FL-O-Ac-SE、BODIPY-C3-SE、FMOC-SE

          8)異硫氰酸酯類衍生試劑

          紫外衍生試劑:異硫氰酸苯酯

          熒光衍生試劑:異硫氰酸苯酯、4-N,N-對二甲胺基偶氮苯-4ˊ-異硫氰酸酯(DABITC )、4-5,6-二甲氧基苯并噻唑)苯異硫氰酸酯、熒光素異硫氰酸酯(FITC

          9)其他

          紫外衍生試劑:三酮

          二、羥基的衍生化反應

          1)酰鹵類衍生試劑

          紫外衍生試劑:對硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、對甲氧基苯甲酰氯等。

          熒光衍生試劑:9-芴甲氧基羰酰氯(FMOC)、9-芴乙氧基羰酰氯(CEOC)、

          2)磺酰鹵類衍生試劑

          熒光衍生試劑:DNS-Cl,2-芴磺酰氯、丹磺酰氯

          3)鹵代三嗪類

              熒光衍生試劑:1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪)萘(EDTN

          4)羰基氰類

              熒光試劑:-1-羰基

          5)苯基異硫氰酸酯類衍生化試劑

          三、羧基的紫外衍生

          1)重氮甲烷類

          熒光衍生試劑:9-蒽重氮甲烷(ADAM)、1-芘重氮甲烷

          2)α-溴代羰基化合物類

              紫外衍生試劑:4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、苯甲酰溴、萘甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、對溴基苯甲酰溴、對硝基苯甲酰溴等

          3)烯丙基溴類

                  熒光衍生試劑:4-溴甲基-7-甲氧基香豆(BrMMC

          4)哌嗪基類

                  熒光衍生試劑:7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃(DBD-PZ

          5)磺酸酯類

          6)其他

          熒光衍生試劑:9-(2-羥乙基)-吖啶酮 HEA、4-氨甲基-6,7-二甲基香豆素 (ADMC)

          四、羰基化合物的反應

          含有(NH2-NH2)或胺基(-NH2)的化合物易與含有醛基和酮基的化合物發生縮合反應,分別生成相應的和席夫堿化合物。因此,NH2-NH2 -NH2可以作為羰基化合物衍生試劑的活性基團。

          1)肼類化合物

             紫外衍生試劑:2,4-二硝基苯肼(DNPA)、

             熒光衍生試劑:DNs-H、CEOC-H

          2)  胺類化合物

          紫外衍生試劑舉例:對硝基芐基羥胺

                    熒光衍生試劑:氨基甲基芘

           

           

          五、巰基化合物

          1)碘乙酰胺類

          2)馬來酰亞胺

          3)芐基鹵化物

          4)溴甲基酮

              本綜述未對詳細的反應條件進行一一列舉,讀者可以根據需求查閱文獻確定相關試驗方案。

           

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